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多聚甲醛固定,没那么简单

发布时间:2021-06-19 14:36网友原创评论

很多朋友在关注《 多聚甲醛固定,没那么简单》,下面带大家一起来阅读吧!

普财网小提示:多聚甲醛固定,没那么简单

多聚甲醛固定,确实是老生长谈,很多研究生在做实验时,可能很多师兄师姐都让他们用多聚甲醛固定,有些可能是为了长时间保存样本,希望集中起来染色,有些可能是染色后排不上队,想保持长时间质量稳定。于是就这么口口相传下来了。

预固定问题

做科研或临床时,可能很多FLOWER习惯性都会用4%多聚甲醛预先固定标本,可能出于三个目的: (1)为了灭活标本里面可能存在的微生物(细菌、病毒等),起到安全保障作用。 (2)希望标本能够较长时间存放。 (3)做胞内染色前的准备。 但是,可能很多人忽视了一点,就是如果在染色之前用多聚甲醛固定标本,细胞表面有些位点在固定后构象发生改变,使得抗体无法结合产生假阴性,也可能由于固定作用,导致其它位点产生非特异性结合(假阳性)。

因此,知道哪些抗体染色前不能预固定,十分重要。幸好,我们自己不用做验证,在Biolegend公司网站[1],贴心的技术人员已经帮我们做了一系列测试,下面两张表,一张是人类抗原,一张是小鼠抗原,可以看的出来,大多数不能做预固定的抗体都是趋化因子受体,所以,大家在实验中千万要注意不要先固定后染色。

 多聚甲醛固定,没那么简单

表1、4%多聚甲醛预固定对各种抗体表面染色的影响(人类),打勾的为允许预固定,打叉的表示预固定影响很大

表2、4%多聚甲醛预固定对各种抗体表面染色的影响(小鼠),打勾的为允许预固定,打叉的表示预固定影响很大

染色后固定问题

染色后的固定,就与抗原构象关系不大了,更多的是荧光素。以前4色以内的时候,用的荧光素都是非串联的,因此大多数影响不大,但随着各种新型串联染料的出现,多聚甲醛固定就成了问题了。

事实上,当你去搜索串联染色标记(如PE-cy7、APC-cy7等)的抗体时,会发现一些比较详细的描述里面会注明(以BD网站搜索APC-cy7各类抗体为例):

Fixed cells should be analyzed within 4 hours of fixation in paraformaldehyde or transferred to a paraformaldehyde-free buffer for overnight storage.

意思就是用多聚甲醛固定过的样本,必须在4小时内检测,否则容易导致串联染料降解,若要长时间保存,还是需要洗涤后,转移到不含多聚甲醛的缓冲液中。

需要注意的是,做GFP荧光检测的同学,也需要注意一下,多聚甲醛固定也会影响GFP,New York Medical College的Paul A Lucas认为是由于多聚甲醛固定后,并非使GFP荧光淬灭,而是使GFP蛋白构象发生改变,无法产生荧光[2]。有时候你固定后检测到的荧光可能是自发荧光,或剩余的未被改变构象的GFP发出的。

解决方案

1、如果检测的是前述表格中容易被多聚甲醛影响的分子,请尽量不要预固定,如需长期保存样本,可以考虑冻存单个核细胞。

2、如果检测的是前述表格中不会受多聚甲醛影响的分子,可用1%多聚甲醛预固定保存,但不能长时间使用,否则对细胞FSC、SSC和荧光强度影响大。此时可考虑使用流式中文网的FlowGuard细胞保存液[3],FlowGuard是国内专利性原研产品,不含多聚甲醛,能缓释出一种特殊的弱固定成份,FSC的变化较多聚甲醛轻微,对抗原强度保持更长久,样本:保存液=6:1~10:1,21天内检测结果稳定性好。

3、如果希望在染色后保持24小时左右的荧光稳定,仍首选建议:避光、4度,我们曾经在10色(BV405、KO、FITC、PE、ECD、PE-cy5.5、PE-cy7、APC、APC-A700、APC-cy7)流式方案非正式测试时,曾经测过数例,在避光、4度保存24小时后,荧光强度几乎无变化,细胞分群良好。 如果仍不放心,可考虑购买商品化的适用于串联染料的专用保存剂。

References

[1] Biolegend公司网站: https://www.biolegend.com/fixation

[2] New York Medical College的Paul A Lucas认为是由于多聚甲醛固定后,并非使GFP荧光淬灭,而是使GFP蛋白构象发生改变,无法产生荧光: https://www.researchgate.net/post/GFP_fluorescence_after_fixation10

[3] 流式中文网的FlowGuard细胞保存液: https://kdt.im/PhQvsr

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